Dr. Claudio M. Gattuso, resp. Area Servizi Sicurezza sul Lavoro, Aware Lab srl, Milano

Introduzione

Molte aziende si stanno organizzando per la gestione delle attività professionali e produttive in un regime di convivenza con il Coronavirus e come è noto esistono protocolli anti-contagio diffusi dalle autorità e condivisi con gli organismi paritetici e le rappresentanze datoriali e sindacali.

Le misure comprendono il rispetto della distanza di sicurezza, la gestione degli ingressi, l’intensificazione delle misure di sanificazione e pulizia, l’adozione di adeguati DPI e tutta una serie di misure di tipo organizzativo che le aziende dovranno adottare per poter riprendere le attività in modo funzionale e sicuro, sia per i lavoratori che per la salute pubblica.

Il rispetto delle misure anti-contagio dovrebbe quindi garantire di limitare la possibilità di trasmissione del virus negli ambienti di lavoro ove l’esposizione potenziale può derivare dal contatto e dall’interazione con altre persone, che magari inconsapevolmente, hanno contratto la malattia in forma asintomatica e quindi possono essere veicolo di infezione involontario.

Ci vogliamo invece concentrare qui sulle realtà di laboratorio in cui l’esposizione al Coronavirus può essere veicolata dalla manipolazione consapevole e deliberata del virus stesso, per motivi di ricerca per esempio, piuttosto che dalla manipolazione di campioni biologici di derivazione umana, potenzialmente infetti.

Per queste realtà occorre adottare misure specifiche, derivanti da una preliminare valutazione del rischio rivolta prima di tutto alla verifica della conformità degli spazi e degli ambienti di lavoro e quindi, validata questa prima analisi, alla misurazione del rischio e alla conseguente adozione delle necessarie misure tecniche, organizzative e procedurali per ridurlo a livelli di accettabilità.

Con il presente articolo si vuole fornire una guida sulla biosicurezza all’interno dei laboratori che manipolano campioni clinici di pazienti positivi (o sospetti tali) al nuovo agente patogeno identificato come COVID-19. Vengono inoltre illustrate le modalità procedurali e tecniche per la corretta gestione di campioni biologici di derivazione umana sospetti positivi o presunti tali. Verranno anche prese in considerazioni alcune raccomandazione utili per la gestione della sicurezza in tutti i laboratori chimici, biologici, biotecnologici, fisici, in cui il rischio è rappresentato dalla presenza di eventuali lavoratori positivi al Covid19.

È comunque importante sottolineare che in considerazione delle attuali limitate conoscenze della malattia causata dal 2019-nCoV, l’OMS continua a monitorare gli sviluppi della pandemia e degli studi scientifici a riguardo e si riserva di rivedere le indicazioni di seguito illustrate in caso dovessero emergere nuove evidenze.

Fino a quando non saranno disponibili ulteriori informazioni, è necessario prendere precauzioni nel maneggiare i campioni sospettati o confermati per SARS-CoV-2 da parte del personale di laboratorio. La comunicazione tempestiva tra il personale clinico e quello di laboratorio è presupposto essenziale per ridurre al minimo il rischio di manipolazione dei campioni da pazienti infetti.

Tali campioni devono essere sempre etichettati di conseguenza e il laboratorio deve essere avvisato preventivamente per garantire la corretta manipolazione dei campioni.

Sicurezza Biologica in laboratorio

Qualsiasi test per la presenza di 2019-nCoV o di campioni clinici di pazienti che soddisfino la definizione di caso sospetto deve essere eseguito in laboratori adeguatamente attrezzati e da personale addestrato nelle relative procedure tecniche e di sicurezza.

In linea generale devono essere rispettate le linee guida nazionali sulla biosicurezza dei laboratori. Le informazioni generali relativamente allo sviluppo e agli aggiornamenti delle linee guida sulla biosicurezza dei laboratori, sono costantemente reperibili consultando il Manuale sulla biosicurezza dei laboratori dell’OMS, (3a edizione) http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/

Elementi chiave delle Linee guida OMS

Ogni laboratorio che prevede di manipolare campioni di Covid19 o campioni sospetti di essere infetti, dovrebbe eseguire una specifica valutazione di rischio biologico finalizzata alla verifica preliminare della conformità rispetto ai requisiti definiti dalla OMS per garantire che siano rispettate le misure minime necessarie previste per la tutela dei lavoratori e della salute pubblica, rispettivamente le barriere di protezione primarie e secondarie.

La valutazione del rischio che ne consegue, una volta appurata la conformità degli ambienti di lavoro, è quindi rivolta a identificare e mitigare i rischi.

Le valutazioni del rischio e le misure di mitigazione devono essere sviluppate tenendo in considerazione:

  • Le procedure eseguite
  • L’identificazione dei pericoli coinvolti nel processo e/o nelle procedure
  • Il livello di competenza del personale che esegue le procedure
  • L’attrezzatura e la struttura di laboratorio
  • Le risorse disponibili
  • I rischi residui

Nella manipolazione e nella lavorazione dei campioni, compreso il sangue per i test sierologici, devono essere seguite le pratiche e le procedure di laboratorio che sono fondamentali per le buone pratiche e procedure microbiologiche (GMPP). Le precauzioni standard per questo tipo di attività includono l’igiene delle mani e l’uso di dispositivi di protezione individuale (DPI), come camici da laboratorio o tute, guanti e protezioni per gli occhi

La manipolazione di campioni provenienti da casi con infezione sospetta o confermata destinati ad ulteriori test di laboratorio come l’ematologia o l’analisi ematologica, devono seguire le linee guida nazionali previste per la manipolazione di materiale potenzialmente infettivo.

Nei paragrafi che seguono sono state identificate le attività che possono prevedere l’esposizione deliberata o potenziale al nuovo COVID19, e tracciate le linee guida operative utili per gli RSPP e i Datori di lavoro che hanno l’obbligo di effettuare la valutazione del rischio e di adottare le misure derivanti.

Raccomandazioni relative alle condizioni di lavoro minime/essenziali associate a manipolazioni specifiche in ambienti di laboratorio 

In tutte le attività di laboratorio in cui non vi sia manipolazione diretta del nuovo Coronavirus sussiste la probabilità di contagio derivante dalla presenza di altri soggetti anche asintomatici. In tali attività è importante, analogamente alle altre attività professionali, attenersi alle misure anti-contagio previste dai protocolli nazionali per il contenimento della diffusione (rispetto delle distanze di sicurezza, impiego di DPI, riorganizzazione dei turni e degli spazi di lavoro.). È comunque importante sottolineare che, anche per queste attività che non prevedono l’impiego diretto del Virus, il datore di Lavoro in collaborazione con RSPP e Medico, dovranno valutare l’integrazione della analisi del rischio e adottare le derivanti misure di contenimento, prevenzione e protezione.

Le seguenti raccomandazioni specifiche fornite sono state invece elaborate analizzando specifiche attività di laboratorio comportanti la manipolazione di campioni a rischio biologico COVID19. Per ogni tipologia di attività vengono, elencate le condizioni di lavoro minime/essenziali associate agli ambienti di laboratorio:

Valutazione del rischio

La valutazione del rischio è un processo sistematico e obbligatorio di raccolta di informazioni e di valutazione della probabilità e delle conseguenze dell’esposizione o del rilascio di pericoli sul luogo di lavoro e di determinazione delle misure di controllo del rischio appropriate per ridurre il rischio a un livello accettabile.

È importante notare che i pericoli da soli non rappresentano un rischio per l’uomo o per gli animali. Pertanto, è necessario considerare anche i tipi di attrezzature utilizzate e le procedure che saranno eseguite con l’agente biologico. Si raccomanda vivamente di iniziare con l’esecuzione di una valutazione del rischio locale in ogni fase del processo, raccolta del campione, ricezione del campione, test clinici, PCR e isolamento del virus (solo quando e dove applicabile).

Alcuni pericoli saranno poi oggetto di ulteriore valutazione per ogni fase del processo quali, ad esempio, l’esposizione all’aerosol durante la lavorazione del campione, la possibile esposizione oculare, la fuoriuscita di materiale di coltura infettivo, situazioni che meritano infatti un approfondimento da parte del RSPP..

Per ogni rischio identificato, devono essere quindi individuate e attivate le adeguate misure di controllo del rischio, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, le seguenti raccomandazioni rivolte a ridurre i rischi residui al minimo possibile.

Procedure di laboratorio di routine, compreso il lavoro diagnostico non propagativo e l’analisi mediante PCR

Il lavoro di laboratorio diagnostico non basato sulla cultura virale, e l’analisi PCR su campioni clinici di pazienti sospettati o confermati di essere infettati dal nuovo coronavirus, sono attività che dovrebbero essere condotte adottando pratiche e procedure descritte per i laboratori clinici e microbiologici convenzionali almeno di grado 2 (BSL2)

Tutte le manipolazioni di materiali potenzialmente infettivi, compresi quelli che possono causare spruzzi, goccioline o aerosol di materiali infettivi (ad es. carico e prelievo di provette dalla centrifuga, miscelazione, agitazione o miscelazione vigorosa, sonicazione, apertura di contenitori di materiali infettivi la cui pressione interna può essere diversa da quella ambientale), devono essere eseguite in cabina di sicurezza Biohazard di classe II (Biosafety cabinet BSC-2) adeguatamente mantenuta e convalidata da parte di personale qualificato o in struttura di analogo contenimento adeguatamente verificata e approvata dal RSPP.

In considerazione dell’esito della valutazione di rischio eseguita sulle specifiche attività da parte del RSPP e del medico Competente, è possibile che sia richiesta l’adozione di misure aggiuntive di tipo procedurale che possono prevedere l’intensificazione delle attività di disinfezione, l’impiego di DPI aggiuntivi e specifiche pratiche di manipolazione, conservazione, trasporto e smaltimento tipiche di un livello di contenimento 3. Tali misure aggiuntive classificano il rischio in grado BSL2+ o BSL2* o BSL2 potenziato.

Esempi di procedure di laboratorio che ricadono all’interno di questa categoria sono:

  • Analisi diagnostica di siero, sangue (compresa ematologia e chimica clinica), campioni respiratori come tamponi nasofaringei e orofaringei, espettorato e/o aspirato endotracheale o lavaggio broncoalveolare, feci o altri campioni;
  • Esame di routine di colture micotiche e batteriche sviluppate da campioni delle vie respiratorie.
  • Utilizzo di strumenti di dispensazione e di analisi automatici
  • Colorazione e analisi microscopica di strisci
  • Esame patologico ed elaborazione di tessuti fissati in formalina o inattivati in altro modo
  • Analisi molecolare di estratti di acido nucleico
  • Imballaggio finale dei campioni per il trasporto ai laboratori diagnostici per ulteriori test (i campioni devono essere già in un contenitore primario sigillato e decontaminato)
  • Utilizzo di campioni inattivati, ad esempio acidi nucleici estratti da campioni biologici
  • Esecuzione di studi al microscopio elettronico con griglie fissate con glutaraldeide

Isolamento virale 

La manipolazione di materiali con elevate concentrazioni di virus vivi (come ad esempio durante l’esecuzione di test di propagazione del virus, di isolamento o di neutralizzazione del virus) o di grandi volumi di materiali infettivi deve essere effettuata solo in laboratori di classe 3 (BSL3) da personale adeguatamente addestrato e competente in grado di soddisfare i seguenti requisiti aggiuntivi di contenimento:

  • Un sistema di ventilazione controllata che mantenga il flusso d’aria direzionale verso l’interno nella stanza del laboratorio. (laboratorio in depressione rispetto alle zone limitrofe)
  • Accesso al laboratorio tramite bussola di ingresso a porte interbloccate con lavabo dedicato per il lavaggio delle mani con azionamento hand free
  • L’aria espulsa dalla stanza del laboratorio non deve essere ricircolata in altre aree all’interno dell’edificio e deve essere filtrata con filtro HEPA (H13 o H14), se ricondizionata e ricircolata all’interno del laboratorio. Se l’aria viene espulsa all’esterno, deve essere dispersa lontano dagli edifici occupati e lontano dalle riprese d’aria. (almeno 10 metri) Anche quest’aria deve essere filtrata con filtri HEPA.
  • Tutte le manipolazioni di materiali infettivi o potenzialmente infettivi devono essere eseguite in BSC 2 (o superiore) adeguatamente mantenuta e convalidata da parte di personale qualificato
  • Gli operatori di laboratorio devono indossare dispositivi di protezione, compresi doppi guanti usa e getta, camici monouso o tute con maniche che coprano completamente gli avambracci, rivestimenti per la testa, copriscarpe o scarpe dedicate, protezione per gli occhi a tenuta (occhiali o visiera).
  • La valutazione del rischio deve prevedere l’uso di una protezione respiratoria (respiratore antiparticolato testato per l’adattamento, ad esempio EU FFP2, US 6 NIOSH-certificato come protezione di grado N95 o superiore).
  • In laboratorio non devono essere presenti lavabi
  • La centrifugazione dei campioni deve essere eseguita utilizzando rotori di centrifuga sigillati o provette sigillate per evitare la dispersione di aerosol. I rotori e le provette dovrebbero essere caricati e scaricati in una BSC di classe 2 o superiore.
  • Il trattamento iniziale (prima dell’inattivazione) di tutti i campioni, compresi quelli per il sequenziamento e la PCR, deve avvenire in cappa di sicurezza biologica BSC2

Rischi aggiuntivi associati agli studi sull’isolamento del virus

Alcune procedure sperimentali possono comportare rischi aggiuntivi di mutazioni del virus con possibile aumento della patogenicità e/o trasmissibilità, o di virus con alterata antigenicità o suscettibilità ai farmaci. Prima di eseguire una qualsiasi delle seguenti procedure è necessario effettuare valutazioni specifiche del rischio e adottare misure specifiche di riduzione del rischio:

  • Coinfezione di colture cellulari con diversi coronavirus, o qualsiasi procedura che possa risultare in una coinfezione;
  • Coltura di virus in presenza di farmaci antivirali;
  • Modifica genetica deliberata dei virus.

Procedure con elevata probabilità di generare goccioline o aerosol

In generale tutte le procedure tecniche devono essere eseguite in modo da ridurre al minimo la possibilità di generazione di aerosol e di goccioline.

Per le procedure ove non sia tecnicamente possibile eliminare la possibilità anche accidentale di produrre aerosol o goccioline, utilizzare sempre una cappa biohazard di classe II (BSC2) o superiore con applicazione di precauzioni aggiuntive per fornire una barriera tra il campione e il personale. Esempi di queste precauzioni aggiuntive (tipiche di un livello di contenimento BSL2+ come sopra descritto) includono l’impiego dispositivi di protezione individuale (DPI), come doppi guanti, maschera Facciale Filtrante FFP3, o altre barriere fisiche, come ad esempio una protezione antispruzzo; rotori per centrifuga sigillati, sistemi di protezione collettiva rivolti a isolare l’attività a rischio.

Sarà quindi l’esito della valutazione del rischio biologico specifica dell’attività che andrà a determinare se l’introduzione di tali misure aggiuntive possa ritenersi giustificata in considerazione di fattori che alzano il livello di rischio quali, ad esempio, l’impiego di elevati volumi di campioni e la probabilità di generare goccioline e aerosol infettivi.

Invio di campioni a laboratori con adeguate misure di contenimento in loco 

I laboratori che, in considerazione dell’esito della valutazione di rischio specifica, non risultino in grado di garantire il rispetto delle caratteristiche di biosicurezza di cui sopra dovrebbero prendere in considerazione il trasferimento di campioni a laboratori di riferimento nazionali, regionali o internazionali con capacità di rilevamento 2019-nCoV in grado di soddisfare i requisiti di biosicurezza previsti sopra descritti

Test su campioni ambientali

Le attività che prevedono la possibilità di concentrare la carica virale, come la precipitazione o la filtrazione su membrana, possono essere eseguite solo in un laboratorio BSL-2 e precauzioni di tipo procedurale tipiche di un livello BSL-3, (laboratorio BSL2+). Particolare attenzione in queste attività, anche durante le fasi di campionamento, alla protezione delle vie respiratorie (suggerito un livello elevato di protezione garantito da facciali filtranti FFP3 (N99 o N100) e di, una anticamera all’ingresso dei laboratori, per la vestizione e la svestizione dei DPI e degli indumenti di laboratorio.

Tutte le attività devono essere eseguite in una BSC certificata di Classe II o superiore adeguatamente manutenuta da personale qualificato con l’adozione dei presidi tipici di un contenimento BSL2+

Queste indicazioni sono rivolte a quei laboratori che eseguono procedure di concentrazione di virus, come test di sorveglianza delle acque reflue / fognarie, e non sono rivolte invece ai laboratori di diagnostica pubblica o di salute pubblica che gestiscono campioni clinici COVID-19 o laboratori che eseguono la coltura e l’isolamento di SARS-CoV-2.

Metodi di disinfezione

I coronavirus umani in generale sono noti per persistere su superfici inanimate come metallo, vetro o plastica per un tempo massimo stimato di qualche ora.

Alla luce delle caratteristiche genetiche comparabili con SARS-CoV e MERS-CoV è probabile che il 2019-nCoV possa essere sensibile ai disinfettanti con comprovata attività contro i virus con involucro, incluso l’ipoclorito di sodio (candeggina) (ad es. 1.000 ppm (0,1%) per la disinfezione generale della superficie (10.000 ppm (1%) per la disinfezione delle fuoriuscite di sangue), 62-71% etanolo, 0,5% di perossido di idrogeno, composti di ammonio quaternario e composti fenolici, se usati secondo le raccomandazioni del produttore.

Per altri agenti biocidi, quali ad esempio quelli a base di benzalconio cloruro 0,05-0,2% o a base di clorexidina digluconato 0,02% potrebbero essere meno efficaci.

Particolare attenzione deve essere prestata non solo alla selezione del disinfettante, ma anche al tempo di contatto (ad es. 10 minuti), alla diluizione (cioè alla concentrazione del principio attivo) e alla data di scadenza dopo la preparazione della soluzione di lavoro, che potrebbe condizionare l’efficacia del prodotto. La rotazione dei disinfettanti in questo caso può essere utile per evitare fenomeni di resistenza di ceppi batterici presenti

Confezionamento e trasporto

Tutti i materiali biologici infetti con COVID19 o sospetti tali, trasportati all’interno e tra i laboratori devono essere collocati in un contenitore secondario sigillato per ridurre al minimo il rischio di rottura o di fuoriuscita.

Esempi di trasferimento all’interno dei laboratori comprendono lo spostamento dei campioni dalla BSC a un incubatore o alla centrifuga e viceversa. I campioni prima di essere introdotti in BSC e prima di uscirne, devono essere preventivamente decontaminati con sostanza alcolica su ogni superficie.

Il trasporto deve essere effettuato da personale informato, formato e addestrato, a conoscenza dei rischi e indossando i DPI previsti

I campioni potenzialmente infetti devono essere trasportati all’interno utilizzando due contenitori, primario e secondario come descritto di seguito:

Involucro primario contenente il campione, antiurto ed a tenuta; involucro secondario con carta assorbente in quantità sufficiente da contenere eventuali fuoriuscite, anch’esso antiurto e a tenuta, adeguatamente etichettato

Il trasporto deve essere eseguito nel più breve tempo possibile senza correre o affrettarsi, utilizzando i percorsi più brevi e quelli meno frequentati, evitando di utilizzare ascensori comuni aperti al pubblico.

Per le spedizioni e i trasporti fuori dall’azienda è importante attenersi alle disposizioni disciplinate dalle regolamentazioni per il trasporto di merci pericolose. In particolare, i campioni dei pazienti provenienti da casi sospetti o confermati devono essere trasportati come UN3373, “Sostanza biologica, categoria B”, quando sono trasportati a scopo diagnostico o investigativo. Le colture o gli isolati virali dovrebbero essere trasportati come Categoria A, UN2814, “Sostanza infettiva, che colpisce gli esseri umani”. Tutti i campioni trasportati (siano essi UN3373 o UN2814) devono essere imballati, etichettati e documentati in modo appropriato.